薄基底膜肾病Ⅳ型胶原α链分布的免疫组化研究

张承英　朱世乐　章友康　郑欣　鄂洁　侯平

　　薄基底膜肾病（TBMN）是以持续性镜下血尿为主要表现的一种遗传性肾病，肾小球基底膜（GBM）弥漫性变薄为该病惟一重要的病理学特征。既往关于Alport综合征（Alport syndrome,AS），另外一种以持续性镜下血尿,GBM变薄增厚、撕裂、分层为特征的遗传性肾病，Ⅳ型胶原α链分布的免疫组化研究较多，众多研究表明, AS患者肾小球基底膜Ⅳ型胶原α3、α4、α5链表达缺陷^［1］,而关于薄基底膜肾病Ⅳ型胶原α链分布的研究甚少。本研究旨在以正常肾组织和AS患者的肾组织为对照,用抗肾抗体,抗Ⅳ型胶原α3,α5链NCl区单克隆抗体通过间接免疫荧光法观察TBMN肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链的分布。
　　一、资料与方法
　　1.TBMN 30例冰冻切片，取自1994年12月至1998年4月，经电镜超微结构检查并结合临床及其他实验室检查证实为TBMN的肾活检组织。其中男5例,女25例,年龄13～53岁,平均34.3岁,病程1个月～24年,平均50.6个月。所有病例均有镜下血尿,尿红细胞位相检查为肾小球源性血尿（尿红细胞大小不等,形态变异）,17例为单纯性血尿,13例为血尿伴蛋白尿,多为轻度蛋白尿,其中3例表现为肾病综合征,4例合并有高血压,除1例表现为肾病综合征者肾功能轻度受损外（肌酐清除率57 ml/min）,其余患者肾功能均正常,所有患者均无白内障,斜视等眼疾和神经性耳聋。
　　2.AS 5例冰冻切片，取自1991年1月至1998年4月，经电镜超微结构检查并结合临床及其他实验室检查证实为AS的肾活检组织,其中男3例,女2例,年龄14～31岁,平均21.6岁,病程3个月～24年,平均67.6个月。所有患者均以血尿伴蛋白尿为主要表现,2例合并有高血压,1例肾功能轻度受损（肌酐清除率73.9 ml/min）,2例双耳轻度神经性耳聋,1例合并先天性白内障。
　　3.正常对照:肾肿瘤手术所取的远离肿瘤组织的正常肾组织为正常对照,共2例,2例均无肾炎病史,无TBMN和AS及其家族史。
　　4.实验试剂：抗Ⅳ型胶原α3和α5链NCl区单克隆抗体购自瑞典Wieslab公司，抗肾抗体为本院1例Goodpasture综合征患者血浆置换出的血清，抗Ⅳ型胶原单克隆抗体，FITC标记羊抗鼠IgG、羊抗人IgG均购自北京中山生物技术有限公司，以抗Ⅳ型胶原单克隆抗体为*抗体的阳性对照，不加一抗为阴性对照。
　　5.方法:5 μm冰冻切片在空气中自然干燥,丙酮4℃固定10分钟,0.01 mol/L MPBS冲洗3分钟,3次,再用6 mol/L尿素，0.01 mol/L甘氨酸（pH 3.5）4℃变性1小时,0.01 mol/L PBS冲洗3分钟,3次,加入一抗和二抗分别在室温下孵育1小时后,荧光显微镜下观察结果。
　　二、结果
　　经间接免疫荧光检查,抗Ⅳ型胶原单克隆抗体、抗肾抗体、抗Ⅳ型胶原α3和α5链NCl区单克隆抗体在2例正常肾组织和30例TBMN患者肾小球均呈连续线状沉积,其中抗肾抗体、抗Ⅳ型胶原α3链NCl区单克隆抗体主要沿GBM、肾小管基底膜沉积,抗Ⅳ型胶原α5链NCl区单克隆抗体主要沿GBM、包曼囊沉积,而5例Alport综合征患者抗Ⅳ型胶原单克隆抗体在GBM上呈阳性反应，而抗肾抗体、抗Ⅳ型胶原α3和α5链NCl区单克隆抗体在GBM上均呈阴性反应。
　　讨论　1996年Lemmink等^［2］在TBMN患者的COL4A4基因上发现一由G到A的点突变,推测TBMN的发生与此突变有关。但关于TBMN患者GBM上Ⅳ型胶原α链的分布尚缺乏大宗病例的系统研究。本组通过间接免疫荧光法，在国内运用抗肾抗体、抗Ⅳ型胶原α3和α5链NCl区单克隆抗体检测了30例TBMN患者肾活检冰冻切片,结果30例TBMN患者GBM上Ⅳ型胶原α3、α5链分布正常,与正常肾组织分布没有明显差异,5例病理改变以典型的GBM撕裂,分层为特征的AS患者GBM上Ⅳ型胶原α3,α5链表达缺陷。关于TBMN和AS患者GBM上Ⅳ型胶原α链分布不同的原因目前尚不清楚，可能TBMN患者携带的突变对GBM的抗原性不发生影响，故肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链分布正常，而AS患者编码Ⅳ型胶原α3、α4、α5链的基因中任何一种基因突变致α3、α4、α5链不能形成稳定的Ⅳ型胶原三螺旋结构,使GBM失去了正常的抗原性^［1］，故GBM上Ⅳ型胶原α链表达缺陷。鉴于α链特异的单克隆抗体在TBMN和AS患者GBM上分布的不同，对于某些临床上难以鉴别的TBMN和AS患者可以考虑用免疫组化方法进行鉴别。